細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁組分，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素。其脂多糖（LPS）的兩性大分子成分具有高致熱性。當(dāng)內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入人體血液時(shí)會(huì)引起不同的疾病，嚴(yán)重者可致休克甚至死亡（熱原反應(yīng)）。因此，制藥企業(yè)從原輔料，包材，原液，半成品和成品等各個(gè)環(huán)節(jié)，都需要對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素加以控制。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(BET)是利用鱟試劑來檢測(cè)或量化細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。包括凝膠法（限度實(shí)驗(yàn)、半定量實(shí)驗(yàn)）、光度測(cè)定法（濁度法、顯色基質(zhì)法），可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。

尊龍凱時(shí)對(duì)于內(nèi)毒素檢測(cè)已建立成熟的流程，并已完成上百個(gè)國內(nèi)外新藥和仿制藥的內(nèi)毒素檢測(cè)、方法開發(fā)和驗(yàn)證，項(xiàng)目周期短，速度快，準(zhǔn)確度高，受到客戶的廣泛肯定。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）實(shí)驗(yàn)程序

1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑耗材及器具等
尊龍凱時(shí)使用的相關(guān)內(nèi)毒素檢測(cè)試劑耗材及器具都是經(jīng)過嚴(yán)格的供應(yīng)商篩選并采購，市面上公認(rèn)的且符合要求的相關(guān)試劑和器具，如湛江安度斯品牌的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑和檢查用水等。

2. 確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）
產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般是通過公式L=K/M計(jì)算得到的。其中M為人用每千克體重每小時(shí)最大供試品劑量，可參考藥品說明書或具有權(quán)威性資料的用法用量。尊龍凱時(shí)專業(yè)團(tuán)隊(duì)也可提供相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)并結(jié)合預(yù)篩選試驗(yàn)結(jié)果幫助客戶快速準(zhǔn)確制定相關(guān)限度標(biāo)準(zhǔn)。

3. 計(jì)算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）

4. 復(fù)核鱟試劑靈敏度

5. 藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)

6. 供試品干擾試驗(yàn)以及干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證
凝膠法系利用細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)可形成凝膠的原理，來測(cè)定供試品中的內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定。反應(yīng)過程中會(huì)受到很多因素的影響，經(jīng)常存在干擾問題。例如來自樣品中的主成分、輔劑、甚至一些雜質(zhì)等。大部分的干擾作用都可以通過使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋供試品的方法排除。當(dāng)有些干擾作用僅使用稀釋法不能排除時(shí)，可采用其他方法消除干擾因素，然后再進(jìn)行試驗(yàn)。
基于文獻(xiàn)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)案例等，尊龍凱時(shí)整理出一套完善的各類干擾因素和對(duì)應(yīng)的排除方法，能夠?qū)崿F(xiàn)快速精準(zhǔn)排除干擾并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

干擾因素和排除方法匯總表

干擾因素	排除方法
pH值的干擾	調(diào)節(jié)pH值至6.0~8.0
二價(jià)陽離子濃度不足造成的干擾	添加適量Ca²⁺、Mg²⁺離子緩沖液
內(nèi)毒素聚集造成的干擾	定期渦旋，配制前渦旋
高濃度鹽或糖的干擾	稀釋或使用適當(dāng)超濾設(shè)備
脂質(zhì)體的干擾	加內(nèi)毒素分散劑
內(nèi)毒素吸附的干擾	首選硼硅酸鹽玻璃的稀釋管、反應(yīng)管、刻度吸管，一次性器具應(yīng)選擇聚苯乙烯
表面活性劑的干擾	試驗(yàn)用生理鹽水稀釋供試品，生理鹽水可使供試品鹽化，從而降低其表面活性
酶、酶抑制劑帶來的干擾	將供試品適當(dāng)加熱使酶失活
葡聚糖的干擾	使用抗增液復(fù)溶鱟試劑

7. 供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。

8. 可疑結(jié)果處理程序

實(shí)驗(yàn)人員首先對(duì)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行回顧：檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)、檢驗(yàn)操作、記錄和計(jì)算、儀器狀態(tài)、.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑質(zhì)量、其他異常現(xiàn)象（是否有可能存在污染，環(huán)境、器械等）復(fù)核人員進(jìn)行復(fù)核:若發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)人員檢驗(yàn)過程存在異常，復(fù)核人員以正確的檢驗(yàn)過程重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，以取代最初的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若未發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)人員檢驗(yàn)過程存在異常，為了確定不合格結(jié)果是否由測(cè)試或分析誤差原因造成，復(fù)核人員可重復(fù)實(shí)驗(yàn)。定量試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考不同鱟試劑的使用

案例

背景：脂質(zhì)體輔料工藝研發(fā)和生產(chǎn)項(xiàng)目，由于限度，客戶對(duì)于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法始終沒有開發(fā)成功，如上所說，內(nèi)毒素檢測(cè)中因工藝引入或產(chǎn)品本身存在的一些干擾因素，在稀釋到產(chǎn)品最大有效稀釋倍數(shù)的情況下仍然不能排除干擾，抑制內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)導(dǎo)致供試品陽性對(duì)照組檢測(cè)為陰性。
尊龍凱時(shí)微生物團(tuán)隊(duì)通過一整套相關(guān)干擾因素的排除，基于工藝步驟結(jié)合以往經(jīng)驗(yàn)在短時(shí)間內(nèi)開發(fā)出能夠排除眾多干擾因素的產(chǎn)品前處理方法。
1. 脂質(zhì)體水溶性差
脂多糖的兩親性會(huì)使其對(duì)一些具有疏水基團(tuán)的產(chǎn)品具有親和力，脂多糖與這些產(chǎn)品的結(jié)合會(huì)使其大小和形狀受到影響，以至于影響活性，使內(nèi)毒素試驗(yàn)受到干擾，形成抑制。通過加入適量?jī)?nèi)毒素分散劑使產(chǎn)品中的內(nèi)毒素分離出來，可恢復(fù)內(nèi)毒素的活性。
2. 螯合劑干擾
工藝中引入的試劑含有螯合劑成分會(huì)螯合鱟試劑中的二價(jià)陽離子（如Mg²⁺離子）從而造成而家陽離子不足造成抑制。同時(shí)加入適量Mg²⁺離子緩沖液，排除工藝引入的相關(guān)螯合劑導(dǎo)致二價(jià)陽離子不足的干擾，從而使內(nèi)毒素正常激活鱟試劑的酶反應(yīng)。
綜上排除多種因素干擾，在允許的最大稀釋倍數(shù)濃度下順利通過干擾實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證并完成限量檢查。幫助客戶在短周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速交付。
注：
參考安度斯相關(guān)資料
中國藥典2020版四部通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法及
中國藥典2020版四部通則9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則

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