脂質體藥物研發

• 脂質體，作為一種由磷脂雙分子層構成的微型泡囊，自上世紀60年代被提出以來，便因其獨特的藥物遞送特性而備受關注。脂質體藥物憑借其獨特的優勢，如提高藥物溶解度、改善藥物穩定性、增強藥物靶向性等，在醫藥領域展現出巨大的發展潛力。
  http://doi.org/10.1016/j.ejps.2023.106688
  http://doi.org/10.1016/j.ejps.2023.106688

• 制備分析液相系統

  配備了先進的 Thermo U3000-CAD檢測系統，靈敏度高。
  案例：脂質體化合物（Lipids）的制備案例
  脂質體化合物，無紫外，疏水性比較強，采用Waters 2545-Qda//UV/ELSD制備液相系統進行制備，結合質譜信息，使用DAD/ELSD引導收集, 分離后純度可達98%以上。

• 尊龍凱時可根據以下制備方法，提供脂質體納米微粒制備服務。

  1 溶劑注入法（Solvent injection method）

  溶劑注入法是一種比較簡單制備脂質體的方法，將脂質成分溶解在有機溶劑中，然后將所需的藥物以一定速率注射到有機相中以誘導脂質體的形成。
  
  
  http://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e09394

  2 薄膜分散法（Thin-layer dispersion）

  薄膜分散法簡單易操作，將藥物和脂質溶于有機溶劑后，置于旋轉蒸發儀上減壓除去溶劑，使脂質在容器壁上形成薄膜，再加入合適的水性介質，使脂質薄膜水化脫落即可制備載藥脂質體。
  http://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e09394

  3 逆向蒸發法（Reverse-phase evaporation technique）

  一般是將膜材的有機溶液與藥物水溶液超聲形成W/O型乳液，再減壓蒸發，就可得到脂質體。此法適用于水溶性藥物和大分子活性物質。

  4 擠出法（Extrusion）

  擠出法即脂質體通過外力的作用，擠壓通過孔徑小于自身粒徑的濾膜時，由于剪切力的作用導致其發生形變，從而產生破裂，隨后破裂的雙層立即重新結合，形成更小的脂質體。

  5 微流控（Microfluidic）技術

  微流控制備脂質體是一種高效快速的方法，該技術通過精確控制微流體在微通道中的流動和混合，實現了脂質體的高精度、高均一性的制備。

  尊龍凱時脂質體制備及分析設備

  尊龍凱時擁有的設備體系能夠全面覆蓋脂質體藥物的研發流程，從處方篩選到制備工藝優化，再到詳盡的性能分析與質量控制，盡可能滿足客戶需求。

• 尊龍凱時可提供以下專業服務：

  1 脂質體藥物的結構或功能性成分的質量控制

  2 脂質體藥物的質量研究與控制：

  (1) 鑒別、含量測定和脂質相關降解產物檢查
  (2) 粒徑及其分布、包封率、表面電荷、體外藥物釋放和藥物泄漏；結構和形態、脂膜的熱力學性質、包封體積、包封藥物的狀態
  (3) 其他：pH值、脂質體藥物的藥脂比、粘度、無菌、熱原/細菌內毒素

  3 脂質體藥物的質量標準：

  (1) 性狀
  (2) 鑒別（API、結構或功能性成分（包括脂質和非脂質））
  (3) 檢查（pH、滲透壓摩爾濃度、表面電荷、粒徑及其分布、濁度、包封率、體外釋放率、有關物質、脂質相關降解產物、裝量、殘留溶劑、可見異物、不溶性微粒、無菌、細菌內毒素）
  (4) 含量（API、結構或功能性成分（包括脂質和非脂質））

  4 脂質體藥物的穩定性研究：

  (1) 性狀
  (2) 檢查（pH、滲透壓摩爾濃度、表面電荷、粒徑及其分布、濁度、包封率、體外釋放率、有關物質、脂質相關降解產物、可見異物、不溶性微粒、無菌、細菌內毒素）
  含量（API、結構或功能性成分（包括脂質和非脂質））
  案例：腦靶向脂質體研發
  尊龍凱時與美國南加州大學（University of Southern California）攜手，開發一種腦靶向脂質體藥物遞送系統。這一合作項目將尊龍凱時在藥物制劑研發領域的深厚積累與南加州大學在神經科學方面的卓越研究能力進行結合，共同致力于解決藥物遞送領域的一大難題——如何有效跨越血腦屏障（Blood-Brain Barrier, BBB），以實現中樞神經系統疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病、腦腫瘤等）的精準治療。
  脂質體包載藥物（左）及對照（右）

• 納米藥物在體內可能通過被動靶向、主動靶向、物理靶向、化學靶向等方式高選擇性地分于特定的器官、組織、細胞、細胞內結構，改變原形藥物的藥代動力學特征如體內組織分布，并進而影響其安全性和有效性。

  1 試驗系統

  可先開展體外試驗進行早期篩選和安全性風險預評估如細胞攝取及相互作用、補體激活情況等研究。應選擇對毒性敏感的種屬。

  2 受試物

  可先開展體外試驗進行早期篩選和安全性風險預評估如細胞攝取及相互作用、補體激活情況等研究。應選擇對毒性敏感的種屬。應提供生產過程、關鍵質量特征、制劑等方面的信息，如穩定性（藥物和載體的化學穩定性、物理穩定性）、分散劑 /分散方法、納米特性（粒徑、粒徑分布、比表面積、表面電荷、表面配體等）、表面性質（包衣及厚度、配體及密度等）、載藥量、濃度、溶解性、藥物從載體的釋放、納米藥物的聚集狀態及變化過程、表征的方法和檢測標準等。若納米藥物需稀釋和/或配制后給藥，應關注納米藥物配制后在不同濃度、溶媒、體外細胞培養液或者其它體外試驗體系下的穩定性、均一性和藥物釋放率等特征是否發生改變。

  3 試驗設計

  給藥劑量：除采用傳統的質量濃度外可考慮同時提供質量濃度和納米顆粒數目/比表面積的劑量單位信息。
  對照組：包含新藥物活性成分的，設單獨的藥物活性成分組;包含新納米載體的，設無藥納米載體組。
  檢測時間和頻率：可能在組織中清除慢，根據蓄積情況設置檢測時間點和檢測頻率，必要時延長恢復期。

  4 毒性關注點

  免疫原性和免疫毒性：納米藥物主要經單核吞細胞系統的吞細胞潔除，聚集到肝臟、脾臟和淋巴組織等器官組織 。可能吸附不同生物分子(以蛋白質分子為主)形成生物分子層(如蛋白冠)，進而被免疫細胞表面受體識別，產生免疫原性和免疫毒性，還可導致類過敏反應。可能存在免疫增強、免疫抑制、補體活化、炎反應、過敏反應、細胞因子釋放等風險。參考ICH S8。
  神經系統毒性：納米藥物與普通藥物相比更容易透過血腦屏障，有神經毒性風險的藥物應進行安全藥理試驗評估對神經系統的影響。
  遺傳毒性：新藥物活性成分的納米藥物和新納米載體/輔料需要開展遺傳毒性評價。
  生殖毒性：納米藥物可能容易通過胎盤屏障、血睪屏障、血乳屏障等生物屏障，因此應關注生殖毒性風險，參考ICH S5。
  致癌性：參考ICH S1(長期使用的需進行)。
  制劑安全性：同注射劑要求，體外溶血試驗應注意，若納米藥物在溶液中會發生團聚，建議進行體內溶血試驗。
  毒代動力學：部分納米藥物可能在組織中存留的時間較長，組織暴露量高于系統暴露量，在體內某些組織器官發生蓄積，重復給藥后可能產生明顯的毒性反應。

  5 不同給藥途徑的特殊關注點

  經皮給藥：納米藥物可能具有較高的毛囊滲透性或分布至局部淋巴結。毒性試驗中應注意考察不同皮膚狀態(完整、破損、患病)、不同影響因素下(如光照)納米藥物在給藥局部和全身的暴露量差異以及相應的毒性風險。
  皮下給藥：具有更高致敏潛力。需關注不溶性納米藥物在皮下的蓄積和轉移以及相應的毒性風險。
  鼻腔給藥：相比胃粘膜更有利于藥物吸收，可能通過嗅神經通路透過血腦屏障。
  吸入給藥：納米藥物可廣泛分布于肺泡表面，應關注局部/呼吸毒性。應關注不溶性載體類納米藥物在肺部的蓄積和轉移。
  靜脈給藥：與普通藥物不同的組織分布與半衰期。
  口服給藥：不溶性納米成分可能蓄積在某些組織。

  尊龍凱時可提供以上多種給藥方式的納米藥物的非臨床安全性評價，包括符合NMPA、FDA法規申報要求的一般毒性研究、藥代/毒代動力學研究，免疫原性/免疫毒性評估、制劑安全性研究、遺傳/生殖毒性研究、致癌性研究等。

• 通過藥代動力學研究，尊龍凱時能夠準確評估脂質體藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄過程，為藥物的優化提供科學依據。
  載體類納米藥物需要分別測定血液中游離藥物和負載型藥物(總藥物)的濃度。
  某些載體類納米藥物(如PEG化的)靜脈注射后可誘導免疫反應，重復給藥后會加速清除，并在肝脾等組織聚集量增加。即加速血液清除(Accelerated Blood Clearance,ABC)現象。此類載體類納米藥物在多次給藥試驗時，建議考察是否存在ABC現象(如抗PEG抗體)。

  1 分布：

  納米藥物在組織器官中的分布取決于載藥粒子自身的物理化學性質及其表面特性;同時，還受到血中蛋白結合。組織器官血液動力學、血管組織形態(如問隙大小)等多種因素的影響。其中載藥粒子是藥物的運輸工具和儲庫，靶部位/靶點(如腫瘤組織)中的游離藥物是發揮藥效的物質基礎，而其他組織中的游離藥物、我藥粒子、載體材料等則可能是導致毒性/不良反應的物質基礎。
  因此，應進行不同組織中總藥物分布研究，如可行，建議對靶器官和潛在毒性器官中的游離型藥物和負載型藥物分別進行測定。對于緩慢生物降解或具有明顯穿透生理屏障性質的高分子載體材料，建議進行不同組織中總載體材料的分布研究。同時，鼓勵在不同組織中進行總粒子分布動力學和釋藥動力學研究。

  2 代謝：

  載體類納米藥物中的活性藥物及其解聚的載體材料在體內主要經肝臟和其它組織中的代謝酶代謝。此外載藥粒子易被MPS吞噬，進而被溶酶體降解或代謝，可能對藥物和載體材料代謝/降解產物的種類和數量產生影響。因此，應確定活性藥物和載體材料的主要代謝/降解途徑，并對其代謝/降解產物進行分析。

  3 排泄：

  載體類納米藥物中的活性藥物和載體材料可能通過腎小球濾過和腎小管分泌進入尿液而排泄，或通過肝臟以膽汁分泌形式隨糞便排泄。載藥粒子自身一般不易經過上述途徑直接排泄，需解聚成載體材料或載體材料降解后主要經腎臟排泄。因此，應確定給藥后活性藥物的排泄途徑、排泄速率及物質平衡。同時鑒于載體材料的特殊性，建議根據載體材料的具體情況對其開展排泄研究。
  案例 脂質體化合物（Lipids）的制備案例

  適應癥	腫瘤
  給藥途徑	靜脈注射
  研發目的	1.增強藥效，降低劑量。2.降低毒性反應。
  對照組	溶媒對照、空白脂質體對照、普通注射液（非脂質體）對照解放熱量很大，潛在爆炸危險性很高。
  劑量	參考普通注射液毒性及預實驗設計，脂質體高劑量與普通注射液劑量相同

  大鼠TK：同劑量下，脂質體組游離藥物與普通注射液血漿暴露量對比，Cmax降低，但AUC（0-144h）更高，脂質體包裹的藥物具有一定緩釋作用。
  荷瘤小鼠組織分布：同劑量下，脂質體與普通注射液相比，藥物在腫瘤組織中的蓄積量更高，可以更好地發揮藥效。

• 平臺采用先進的生物分析技術，對脂質體藥物進行精確的定量分析，為藥物研發提供有力支持。
  服務內容：開展藥代動力學（PK）和毒代動力學（TK）樣本生物分析工作；全方位支持從早期篩選到臨床前以及臨床各階段的生物分析。

  1 生物分析方法開發和驗證

  (1) 脂質體目標分析物
  指導原則指出進行藥代動力學研究時需測定生物樣本中負載型（或總藥物）和游離型（完全游離+蛋白結合）藥物濃度
  (2) 前處理技術
  蛋白沉淀（PPT）：破壞蛋白質分子的水化作用或者減弱分子間同性相斥作用的因子，使蛋白質在水中的溶解度降低而沉降下來轉化為固體的分離方法。常用有機試劑沉淀、等電點沉淀、鹽析等。
  液液萃取（LLE）：根據化合物極性不同，采用相似相容原理，將分析物或不需要的干擾成分從一個液相（如生物樣品）提取到另一個不混溶液相（如有機溶劑），從而進行樣品清理。常用溶劑有正己烷、甲基叔丁基醚、正丁醇和乙酸乙酯等。
  固相萃取（SPE）：機理類似于液相色譜，通過溶解在液體中的溶質（分析物）與吸附劑材料（固定相）之間的親和力或相互作用實現。常用有反向SPE、離子交換SPE。
  超濾：超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。常用為超濾管。
  此外還有平衡透析、超速離心、排阻色譜、柱切換色譜等分離方法。
  固相萃取（SPE）
  SPE 的大致流程：樣品準備→活化→平衡→上樣→淋洗→洗脫

  2 生物基質樣本分析

  不同生物基質測定
  指導原則中建議對血漿和組織樣品中總藥物和游離藥物濃度進行測定。但是目前組織還是采用物理勻漿處理的方式對樣品進行處理，這勢必會造成脂質體的破碎，所以，現階段技術手段還做不到組織中游離藥物濃度的檢測。

  基質	總藥物	游離藥物
  大鼠血漿	需要	需要
  犬血漿	需要	需要
  猴血漿	需要	需要
  小鼠血漿	需要	需要
  大鼠組織	需要
  小鼠組織	需要
  大鼠排泄	需要

• 尊龍凱時助力合作伙伴濟民可信JMX-2002脂質體注射液獲批臨床

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• 如何在脂質體類藥物生物分析方法開發階段選擇相應的SPE板？

  首先需要判斷化合物的極性：對于弱酸、弱堿及中性化合物，建議選擇硅膠基質的反向SPE板。這類SPE板適用于大多數小分子生物分析，例如Waters的HLB系列和Thermo Fisher的SOLA系列板。

  對于強酸或強堿化合物，則需要考慮離子交換的SPE板。可以選擇Waters的四合一離子交換開發的板，如適用于堿性化合物的Oasis MCX陽離子交換板，適合酸性化合物的MAX陰離子交換板，適合強堿性或季銨類化合物的WCX弱陽離子交換板，以及適合強酸化合物的WAX弱陰離子交換板。

  此外，選擇合適規格的板子也很重要，可以根據樣品的載量（如2毫克、10毫克或30毫克）進行選擇。

• 所有研究均在同一園區內實驗室有序完成，切實保證實驗進度和項目溝通的高效性，占據數據獲取和評估的行業優越性。