mRNA展示技術又稱mRNA-蛋白質融合體展示技術，是將基因型(mRNA)與表型(多肽/蛋白)融合的體外多肽/蛋白篩選技術，將肽與其編碼mRNA進行共價連接，使用嘌呤霉素作為連接物。可用于生物分子配體的發現和相互作用分析。
尊龍凱時應用此技術構建規模超過1013的mRNA展示庫，期間可以通過無細胞PURE體外翻譯系統將非天然氨基酸整合到多肽中，經過靶標蛋白的親和力篩選和洗脫，對與多肽連接的cDNA進行測序，可精準篩選到與靶標蛋白相互作用的多肽。
? DNA庫制備：使用分子生物學技術制備DNA庫(通常為編碼約4~14個氨基酸的環肽)；
? DNA庫的體外轉錄：通過RNA聚合酶的作用，DNA庫被轉錄成mRNA；
? 嘌呤霉素連接：嘌呤霉素分子通過DNA連接子序列連接到每個mRNA上，嘌呤霉素是一種抗生素，作為氨基酰化的tRNA類似物(tRNA在翻譯過程中向核糖體傳遞氨基酸)，并作為mRNA和肽之間的連接子；
? mRNA庫的體外翻譯：mRNA-嘌呤霉素偶聯物進行體外翻譯，由核糖體翻譯生成相應的肽；
? 線性肽的環化修飾：通過化學合成技術進行環化修飾；
? 逆轉錄：mRNA逆轉錄形成mRNA-cDNA雙鏈，產生mRNA/cDNA-嘌呤霉素-肽偶聯物庫；
? 孵育與洗滌：將mRNA-cDNA-肽融合庫與固定在固體載體上的靶蛋白一起孵育，然后進行洗滌以去除未結合的肽；
? 擴增、富集與測序：結合肽的cDNA通過PCR擴增，然后用作DNA庫模板，在進一步的重復幾輪mRNA展示庫篩選中，富集與靶蛋白高親和力的結合肽，最后通過cDNA的測序來確定多肽的結構。
整個過程均在體外進行，無需依靠細胞。
mRNA展示技術的優勢
mRNA展示技術屬于體外展示技術，與包括噬菌體展示技術在內的體內展示技術相比，具有多種優勢，主要體現在更大的化合物庫容量、化合物多樣性、篩選過程和實驗周期等。
? ?更大的化合物庫容量：與噬菌體展示技術相比，mRNA展示技術使用體外轉錄和翻譯(IVTT)，避免了對大腸桿菌轉染的需要(而這限制了噬菌體展示庫的大小在~108個序列)，mRNA展示技術可以制備更大的化合物庫(1012~13個序列)
? 化合物多樣性：可構建引入多種非天然氨基酸的肽庫
? 篩選過程中的反應條件：整個過程在無細胞條件下進行；可完全控制篩選的條件
? 實驗周期：篩選測序周期更短，mRNA展示技術篩選+多肽測序周期2~3周，而噬菌體展示需要6~8周。
總之，mRNA展示技術由于其突出的優勢擁有廣泛的應用場景。
mRNA展示肽庫的環化修飾
? 硫醚環化：基于半胱氨酸與功能基團（如mCNP）的自發或試劑驅動的大環化，適用于單/雙環結構。
? DBX環化：間/對-二溴二甲苯 (DBX) 介導的半胱氨酸硫醚鍵合，形成剛性雙環肽，提升血漿穩定性和靶標親和力。
環化可增強肽穩定性與功能！
基于計算的虛擬篩選 (in silico screening)
整合多種計算方法，加速目標化合物識別與優化：
? 基于結構的對接
利用Rosetta、AutoDock、CrankPep (ADCP)、HADDOCK等工具模擬肽-靶標結合。
? AlphaFold集成
AF-Multimer根據序列預測肽-蛋白復合物，并結合MD模擬進行優化。
1. 固相和液相合成
1）線性肽
2）環肽：S-S橋、內酰胺、硫醚、Click反應等
3）修飾肽：聚乙二醇化、同位素標記、熒光修飾、肽蛋白偶聯等
2. 放大
? 從mg到100 g
? 自動化HPLC純化
? 凍干
參考文獻
[1]. Hayden Peacock, et al. Discovery of De Novo Macrocyclic Peptides by Messenger RNA Display. Trends Pharmacol Sci.2021 May;42 (5):385-397. doi: 10.1016/j.tips.2021.02.004.
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