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高效液相制備純化技術是一種在生物醫(yī)藥行業(yè)中非常關鍵的純化技術，利用不同的化學性質來分離混合物中的各種組分。在醫(yī)藥研發(fā)領域，完整的雜質研究和充分的雜質控制，直接關系到藥品的安全性和有效性，是藥物成功獲批的重要因素之一。

然而，雜質研究的難點在于識別和控制那些在生產過程中或穩(wěn)定性研究中產生的未知且頑固的雜質。這些雜質的生成機制復雜，結構未知，難以通過常規(guī)方法進行追蹤和分析。在這一挑戰(zhàn)面前，制備液相技術成為解決難題的利器。作為一種高效的分離技術，HPLC能夠從復雜的樣品中分離出微量的雜質，為進一步的結構鑒定和毒性評估提供了可能。這不僅解決了雜質研究中的關鍵難題，也為藥品的安全性和有效性提供了更為堅實的保障。

尊龍凱時云講堂邀請工藝分析部李墨，為您深入解析HPLC操作的關鍵注意事項，并提供解決常見操作難題的策略和方法。

點擊下方“http://www.msjidi.com/video/hplc-technology.shtml”，回顧李墨老師的整場直播。

01 剛提到的降低柱溫用來增加化合物保留，但是我遇到過升高柱溫化合物保留也增加的情況，這是什么原因呢？

李墨：在色譜分析中，通常降低柱溫，溶質的保留時間會增加。在少數(shù)情況下，我們化合物的保留時間會隨著溫度增加而增加，原因可能是溶質分子產生了離子化，或者跟溶質分子的結構有關系，或者固定相可能會隨著溫度改變，都可能導致保留時間的增加。

02 制備樣品的溶解性要怎么試？有什么好的建議呢？

李墨：首先拿到樣品之后，建議是先咨詢合成部門同事，詢問化合物是從什么溶劑中旋蒸出來的，了解化合物的原始溶劑。或者進行嘗試，可以稱取幾個約10毫克的樣品于進樣小瓶中，準備進行溶解性測試。向每個樣品中加入100微升的稀釋劑，觀察其溶解性。如果樣品不溶，可以逐步增加稀釋劑量。如果觀察到樣品在中性條件下不溶，可以考慮加入少量的酸或堿以幫助溶解。常用的溶劑一般可以考慮使用甲醇乙腈，如果這些溶劑無法溶解樣品，可以嘗試更通用的溶劑，如二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）或N-甲基吡咯烷酮（NMP）。這些試溶解性的樣品后續(xù)可以用來進行方法開發(fā)，也不浪費樣品。

03 什么是預飽和？目的是什么？

李墨：預飽和技術在色譜分析中扮演著重要的角色，其主要目的是保護色譜柱，并維持其性能的穩(wěn)定性。預飽和可以防止色譜柱內的固定液流失，在流動相進入色譜系統(tǒng)之前，預飽和柱會對流動相進行處理，使其與固定液充分接觸，達到飽和狀態(tài)。飽和之后再進入分析柱當中，就會防止分析柱中的固定液流失，從而保持我們色譜柱的性能不變。

04 保護柱不能超聲應該怎么清洗？

李墨：直播提到保護柱不能夠劇烈超聲，是因為可能會對填料產生一定損傷，如果保護柱出現(xiàn)污染，可以將其擰開并拆開，取出柱芯，使用50%異丙醇溶液進行清洗，以去除表面吸附的樣品。發(fā)生一些強污染的時候，可以像常規(guī)的色譜柱一樣進行單獨的沖洗，把污染物沖出來。要注意定期檢查保護柱的理論塔板數(shù)，以評估柱效是否下降。同時注意壓力是否異常上升，這些可能是更換保護柱的信號。由于保護柱屬于耗材，當性能下降時，只需更換柱芯，無需更換整個色譜柱，這樣可以節(jié)省成本并保持分析的連續(xù)性。

05 結構類似物實戰(zhàn)中用哪些柱子分離呢？

李墨：選擇哪種色譜柱取決于待分離分子的化學性質、大小、極性以及所需的分辨率和選擇性。比如對于苯環(huán)類化合物，特別是鹵代苯（如氯苯、溴苯等），使用苯基柱可以提高分離效果，對于苯環(huán)上的取代基團位置不同，也可以考慮使用五氟苯基柱等等。

06 怎么解決峰型異常的問題？比如分叉峰之類

李墨：在色譜分析過程中，我們可能會遇到一些常見的問題，如樣品過載、溶劑使用不當、色譜柱污染或失效等。這些問題都可能會導致峰型異常，影響分析結果的準確性。解決辦法可以考慮使用降低樣品的載樣量，比如降低它的濃度，或者減少樣品的進樣體積，或者更換樣品溶劑等等，如果色譜柱出現(xiàn)污染或效能降低，更換新的色譜柱可以恢復分析的準確性和重復性。

07 李墨老師特別分享：保留因子K的公式推導過程
保留因子k：用固定相中的溶質分子總量，除以流動相中的溶質分子總量來得到。流動相和固定相中的分子量等于樣品的濃度(Cs和Cm表示)乘以相的體積(Vs和Vm表示),因此可以引導出等式
k=(CsVs)/(CmVm)=( Cs/Cm)/( Vs/Vm)
=KΨ（k是平衡常數(shù)，Ψ是流動相和固定相的比值）
溶質分子肯定會出現(xiàn)在固定相或者流動相里,假設流動相里的溶質分子分數(shù)為R，在固定相的溶質分子分數(shù)就應該是1-R，因此就可以得到
k=(1-R)/R    
或者
R=1/(1+k)   
溶質分子X的保留時間可以定義為距離除以速度，這里的距離就是色譜柱的長度L，色譜帶的速度是ux:
tR=L/ux
同樣地,溶劑峰的保留時間就是
t0=L/u
式中,u是流動相的平均速度。把等式的L去除之后就衍生出下面這個等式
tR=t0u/ux
溶質分子X 通過色譜柱時的移動速率或者速度ux，可以通過計算在任何時間里出現(xiàn)在流動相內的該分子的分數(shù)R 來得出。一般來講，ux應該等于R 乘以移動的速率或者溶劑分子的流動速度U:
ux=Ru0
所以用ux=Ru和R=1/(1+k)進行取代tR=t0u/ux,就得到下面的等式
k=(tR/t0)-1
式中tR 為化合物保留時間，t0為死體積時間

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