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原理

抗體：介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原激活后增殖分化為漿細(xì)胞所合成分泌的一類(lèi)能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。
克隆(clone)： 是指無(wú)性繁殖細(xì)胞系，是由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無(wú)突變發(fā)生，其基因是完全相同的。

多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。

多克隆抗體制備的意義

免疫血清：將抗原注入機(jī)體所產(chǎn)生的抗體是針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體，含有這種特異性抗體的血清。
免疫血清作用：對(duì)傳染病的診斷、預(yù)防和治療有重要意義，而且對(duì)器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。

多克隆抗體優(yōu)缺點(diǎn)

   優(yōu)點(diǎn) ：作用全面，具有中和抗原，免疫調(diào)理，介導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，ADCC等作用，來(lái)源廣泛，制備容易。
   缺點(diǎn)：特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而應(yīng)用受限。

多克隆抗體制備流程

（一）免疫原的制備
（二）免疫動(dòng)物
（三）免疫血清的收集
（四）免疫血清的鑒定
（五）免疫血清的保存

多克隆抗體操作步驟

一、免疫原的制備
免疫原（immunogen）指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工  合成抗原；蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)、核酸抗原；
（一）細(xì)胞性抗原制備：
   綿羊紅細(xì)胞（SRBC）- 溶血素；
   細(xì)菌- 抗菌抗體（動(dòng)物免疫血清）
（二）可溶性抗原制備：指蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)等。
1）細(xì)胞的破碎（物理法、化學(xué)法）
2）提取與純化：

    ①超速離心分離—是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過(guò)差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開(kāi)的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。
②選擇性沉淀—選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境。
③超濾法—利用孔徑大小不同的特制薄膜對(duì)不同分子大小的抗原物質(zhì)進(jìn)行濾篩。
④層析法—凝膠過(guò)濾、離子交換、親和層析
⑤電泳——

3）鑒定：鑒定純化蛋白的含量、相對(duì)分子的質(zhì)量、純度以及免疫學(xué)活性。
（三）半抗原性免疫原的制備

    1.載體選擇
常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。
（1）蛋白質(zhì)類(lèi)：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。
（2）多肽類(lèi)聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類(lèi)良好的載體，常用的有多聚賴(lài)氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體。
2.連接方法
         半抗原與載體的連接有物理法和化學(xué)法。
物理法   是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過(guò)電荷和微孔來(lái)吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；
化學(xué)法   是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到白質(zhì)類(lèi)或多肽類(lèi)聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進(jìn)行連接。

（四）免疫佐劑
某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型，此類(lèi)物質(zhì)稱(chēng)為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡(jiǎn)稱(chēng)佐劑。 

二、動(dòng)物免疫
（一）免疫動(dòng)物的選擇
選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮以下因素：
（1）動(dòng)物的選擇（選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)考慮以下因素）
①抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬的關(guān)系。抗原的來(lái)源與免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。
②動(dòng)物個(gè)體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動(dòng)物（以雄性為佳）；抗體需要量少時(shí)，選用家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物；抗體需要量大時(shí)，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動(dòng)物。
③一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔子和羊；
（二）佐劑
概念：預(yù)先與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的非特異性免疫增強(qiáng)性物質(zhì)。
種類(lèi)：佐劑一般包括以下幾類(lèi)：
①無(wú)機(jī)佐劑：如氫氧化鋁、明釩等
②生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子等；
③人工合成佐劑：  如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；
④油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；
⑤納米佐劑 
佐劑主要作用機(jī)制：
①改變抗原物理性狀，延緩抗原的降解和排除，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)滯留的時(shí)間
②刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其對(duì)抗原的處理和提呈能力
③刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的能力.
（三）免疫乳劑的制備
（四）免疫動(dòng)物

三、免疫血清的收集
采集免疫血清前，要預(yù)先測(cè)試抗體效價(jià)測(cè)定，若效價(jià)達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)會(huì)下降。
①頸動(dòng)脈采血法
②心臟采血法
③靜脈采血法
 
四、免疫血清的鑒定 
1.效價(jià)的測(cè)定：顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。
2.特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法
3.純度的鑒定：抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。
4.親和力的鑒定：測(cè)定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)等。

五、免疫血清的保存
取好血后，放入37℃，30min后，使血清充分析出（不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血），經(jīng)3000rpm/5min分離血清，剩余放進(jìn)-20℃冰箱保存。

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