目前檢測腫瘤細(xì)胞遷移的方法主要有細(xì)胞劃痕實驗及Trans-Well小室遷移實驗，傳統(tǒng)的細(xì)胞劃痕實驗需要連續(xù)觀測以評估藥物對細(xì)胞遷移的作用，因此，其面臨的最大的問題是不能保證每次觀察的都是同一位點，對結(jié)果不能進(jìn)行定量分析，也不能區(qū)分劃痕內(nèi)的細(xì)胞是遷移還是增殖的而來的。而Trans-Well小室遷移實驗雖能定量檢測細(xì)胞遷移的數(shù)量，但不能直觀觀測細(xì)胞遷移過程，也不能將遷移和增殖細(xì)胞區(qū)分出來，而且其價格昂貴，不適合抗腫瘤細(xì)胞遷移藥物的大規(guī)模篩選。

細(xì)胞遷移實驗介紹

細(xì)胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運動等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

Transwell孔徑的選擇

※共培養(yǎng)實驗：在選擇膜孔徑的時候需要考慮實驗的目的和實驗細(xì)胞的大小，當(dāng)膜孔徑小于3μm的時候，細(xì)胞不會遷徙通過，所以如果不涉及研究細(xì)胞運動能力，應(yīng)選擇3μm以下的，通常是0.4μm或者3μm，例如在共培養(yǎng)體系研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)物對細(xì)胞A的影響，就可以把A種在上室里，將B種在下室。
※趨化性實驗：可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室細(xì)胞可穿過聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對上室細(xì)胞的趨化能力。
i.細(xì)胞B對細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì)胞A的趨化作用。
ii.趨化因子對細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細(xì)胞的趨化作用。

腫瘤細(xì)胞遷移實驗（transwell migration）

常用8.0μm（8μm孔徑的膜為文獻(xiàn)中用來做侵襲和轉(zhuǎn)移實驗最常用的規(guī)格，本次訂購的是Corning公司的用來做transwell migration的8μm孔徑的24孔板transwell insert以及用來做transwell invasion的BD公司的8μm的24孔板鋪膠transwell chamber）、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。FBS是最常用的趨化因子，本實驗也準(zhǔn)備選用FBS作為遷徙和侵襲實驗的趨化因子。

腫瘤細(xì)胞侵襲實驗（transwell invasion）

常用8.0、12.0μm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實驗類似，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

細(xì)胞遷移實驗步驟

1、Transwell 小室的制備

※Corning公司的8μm孔徑無膠24孔板transwell insert

i. 預(yù)平衡：在24孔板中和transwell小室中加入培養(yǎng)液，在37℃的培養(yǎng)箱里平衡一個小時或者過夜，這樣能夠增強細(xì)胞的粘附作用。

ii. 正式使用：24孔板中加入含5-10%FBS的培養(yǎng)液0.6ml，將transwell inset 放入板中（用鑷子），在transwell insert中加入無血清的培液0.1ml。（操作手冊提示：實驗過程中，培液的高度需要定時的去觀察，當(dāng)需要維持要求高度的時候可以補加新鮮培液）

※BD公司的8μm孔徑鋪有基層膠的24孔板transwell chamber

i.再水化：從-20℃中取出并打開包裝置于室溫，往transwell小室以及24孔板中各加入37℃的培液0.5ml，然后置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育2h使得基質(zhì)膠再水化。

ii.再水化后：小心的將培液吸走，注意別觸到基質(zhì)膠。

2、制備細(xì)胞懸液

i. 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

ii. 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－5×10⁵個/ml，具體的細(xì)胞密度需進(jìn)行預(yù)實驗，migration與invasion的細(xì)胞密度也有所不同（細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。）

3、接種細(xì)胞

i. 取細(xì)胞懸液體積V1加入Transwell小室，不同規(guī)格Transwell小室對細(xì)胞懸液量有不同要求，參考說明書。Corning公司24孔板transwell insert中加入的體積為0.1ml，BD公司的鋪膠24孔板transwell insert中加入的體積為0.5ml。

ii.24孔板下室一般加入體積V2含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基（FBS濃度需進(jìn)行預(yù)實驗），不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。特別注意：下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。

iii. 常規(guī)培養(yǎng)12－48h，時間點的選擇需考慮到細(xì)胞侵襲能力、趨化因素和細(xì)胞數(shù)目等。

iv. 注意事項

l 需要考慮轉(zhuǎn)oligo之后與NC相比，會不會對細(xì)胞的增值以及凋亡產(chǎn)生影響，如果轉(zhuǎn)oligo后能抑制細(xì)胞增值以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的話，那需要關(guān)注MDA-231侵襲能力的下降是因為細(xì)胞數(shù)目的減少還是因為確實轉(zhuǎn)移和侵襲能力下調(diào)了（是否需要加一個什么都不轉(zhuǎn)的對照組?）

l 時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細(xì)胞內(nèi)會有一定量的MMPs儲存，短時間內(nèi)可能侵襲能力不會有太大改變。同時從oligo的轉(zhuǎn)入到進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程，所以時間太短效應(yīng)不明顯，但是時間的延長不能影響到細(xì)胞增值的改變。

l 細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)有可能不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團(tuán)，屬正常現(xiàn)象（別人的經(jīng)驗，注意觀察）

l 在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但如果出現(xiàn)了大氣泡，一定要去除，否則嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。最好接種細(xì)胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。

4、結(jié)果統(tǒng)計

※去除基層膠和未侵襲出膠的細(xì)胞（參照BD公司的操作手冊）

i. 去除transwell小室中的培養(yǎng)液

ii. 用干凈的濕棉簽，輕柔地但是均一用力擦除小室膜上表面的基質(zhì)膠以及未侵襲出膠的細(xì)胞（invasion），或者擦除未轉(zhuǎn)移跨膜的細(xì)胞（migration）。

iii. 用第二根濕棉簽重復(fù)一次

注意：整個過程應(yīng)該盡量快的完成，以免膜下表面的細(xì)胞干掉。

※細(xì)胞固定與染色

i. 結(jié)晶紫染色法：先固定后染色，各文獻(xiàn)中固定方法不一，大致有以下幾種:100%甲醇固定10min、4%的多聚甲醛固定15min或者100%乙醇固定10min。固定完之后用0.1%的結(jié)晶紫染色染30min。該方法為文獻(xiàn)中最常用的方法（訂購結(jié)晶紫試劑）

ii. 瑞氏染色法：同樣是先固定，可以選用100%甲醇固定10min，隨后用瑞氏染液即A液一倍體積混合B液2倍體積后染色相應(yīng)時間。該染色方法文獻(xiàn)中使用較少，所以染色時間有待摸索，根據(jù)小趙師兄之前的經(jīng)驗應(yīng)該在20分鐘以上。

iii. 使用BD公司的Diff-Quik staining kit：這個方法文獻(xiàn)中也有使用，操作步驟嚴(yán)格按照BD公司的使用手冊，但是須購買BD公司kit，較貴。

※ 細(xì)胞計數(shù)

i.用鋒利的刀片將膜從小室中分離下來，具體是先將刀尖插入膜與小室的邊緣處形成一個小口，然后讓小室逆著刀口的方向旋轉(zhuǎn)，這樣膜就被分離開來，當(dāng)剩下少許連接的時候用鑷子以盡量少的接觸面積夾在膜上，最終將剩余的膜分離。

ii.事先準(zhǔn)備好一塊載玻片，在上面滴一滴油，將分割下來的膜有細(xì)胞面朝上用鑷子置于油上，隨后再在膜上滴加一滴油，蓋好蓋玻片后，置于顯微鏡下拍照計數(shù)。

注：細(xì)胞計數(shù)可以用顯微照相裝置拍下幾個具有代表性的視野然后進(jìn)行計數(shù)，也可以直接在顯微鏡下計數(shù)，前者較優(yōu)。

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Transwell孔徑的選擇

腫瘤細(xì)胞遷移實驗（transwell migration）

腫瘤細(xì)胞侵襲實驗（transwell invasion）

細(xì)胞遷移實驗步驟

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