CRISPR在近幾個(gè)月的醫(yī)藥新聞中可謂出盡了風(fēng)頭，證明臨床療效及安全性的里程碑事件，伴隨著CRISPR不穩(wěn)定、無法控制的基因突變位點(diǎn)研究，把CRISPR基因編輯療法推上風(fēng)口浪尖。下面本文將對(duì)CRISPR及近期事件進(jìn)行梳理，結(jié)構(gòu)如下：
發(fā)現(xiàn)
上個(gè)世紀(jì)八十年代末，日本科學(xué)家在幾種細(xì)菌的基因組上發(fā)現(xiàn)了這么一長串很有個(gè)性的序列，這段序列上多段重復(fù)的DNA序列并間隔有多段千變?nèi)f化的非重復(fù)序列。這一發(fā)現(xiàn)可以說埋下了CRISPR發(fā)現(xiàn)的種子。
二十世紀(jì)初，隨著大規(guī)模基因組測(cè)序技術(shù)的成熟和生物信息學(xué)的興起，人們逐漸積累了大量細(xì)菌物種完整的DNA序列信息。在對(duì)比中研究人員發(fā)現(xiàn)，這段類似的奇怪序列出現(xiàn)在了數(shù)十種細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，且其中的非重復(fù)序列與已知噬菌體的基因組序列信息高度一致。
這種大規(guī)模的發(fā)現(xiàn)證明這段奇怪基因的存在并非是某種巧合，于是生物學(xué)家們便開始猜想并試圖解開這段基因存在的意義。2007年，科學(xué)家在嗜熱鏈球菌中嚴(yán)格證明了CRISPR序列對(duì)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的功能。利用基因重組技術(shù)將一段CRISPR序列人工添加到細(xì)菌中，細(xì)菌便可以產(chǎn)生與該段CRISPR序列基因相同的病毒的入侵。不僅如此，細(xì)菌還可以將這段CRISPR序列整合到自己的基因組中，產(chǎn)生“記憶”，以應(yīng)對(duì)同種病毒的再一起侵襲。
機(jī)制
CRISPR序列與CRISPR associated共同組成了CRISPR/Cas系統(tǒng)，這是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，存在于大約48%細(xì)菌和95%古細(xì)菌中，可提供序列特異性保護(hù)以抵抗外來的DNA甚至RNA。
這個(gè)防衛(wèi)包含三個(gè)階段：
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（1）適應(yīng)性階段，直接重復(fù)序列（repeat）被易變的DNA序列間隔開組成CRISPR序列，此時(shí)的DNA序列稱為spacer。Cas蛋白切割外來DNA片段，外來DNA片段稱為protospacer，然后將其整合到CRISPR序列上，這時(shí)外來DNA片段更名為spacer；
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（2）表達(dá)階段，CRISPR序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、切割成為成熟的crRNA；
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（3）干擾階段，crRNA招募Cas效應(yīng)蛋白復(fù)合物特異性切割病毒同源性DNA。
應(yīng)用
CRISPR可以對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)的定點(diǎn)編輯，隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用，除了基因敲除，基因替換等基礎(chǔ)編輯方式，它還可以被用于基因激活，疾病模型構(gòu)建，甚至是基因治療。
CRISPR在臨床上最早被用來治療β-地中海貧血。Β-地中海貧血是由于患者胚胎DNA序列中的單核苷酸錯(cuò)誤。CRISPR/Cas可以精準(zhǔn)地找到DNA序列中錯(cuò)誤的位點(diǎn)，并進(jìn)行定點(diǎn)修復(fù)，達(dá)到治愈患者的目的。
除了在血液方面的應(yīng)用，CRISPR在癌癥治療當(dāng)中也蘊(yùn)含著很大的潛力，CRISPR與CAR-T細(xì)胞的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手為攻克癌癥帶來了新的希望。2016年7月，Nature報(bào)道了中國盧鈾教授的研究，他計(jì)劃用CRISPR技術(shù)編輯的T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者，此項(xiàng)研究進(jìn)展到11月時(shí)正式將編輯后的T細(xì)胞注射到1例肺癌患者體內(nèi)。在四年后，今年04月份的Nature Medicine上，該團(tuán)隊(duì)發(fā)表文章表明研究支持基因編輯的安全性和有效性。最終結(jié)果顯示，完成12例三線及以上治療失敗的晚期肺癌患者的基因編輯細(xì)胞治療，受試者安全性和耐受性良好，無3級(jí)及以上細(xì)胞治療相關(guān)毒性發(fā)生和治療相關(guān)性死亡。在有效性的證明上，中位無進(jìn)展生存時(shí)間和中位生存時(shí)間的數(shù)據(jù)分別是7.7周和42.6周。
但與此同時(shí)，近期的三項(xiàng)毒理的研究都表明，在人類胚胎進(jìn)行CRISPR基因編輯會(huì)引起大量DNA的缺失和重組。影響基因編輯應(yīng)用的兩個(gè)重大因素為on-target efficiency在靶率和off-target efficiency脫靶率。脫靶率是crRNA不單識(shí)別靶DNA，其他個(gè)別堿基不同的DNA也可識(shí)別并切割，這就產(chǎn)生錯(cuò)配容忍率，應(yīng)用在基因組中，本來只需要切割A(yù)基因，結(jié)果正常的B基因也被切斷了，會(huì)造成生物安全性問題。然而近期的研究表明，CRISPR/Cas9也會(huì)在目標(biāo)位點(diǎn)附近引入不必要的突變，也就意味著on-target在靶率中也有一部分會(huì)在基因編輯中產(chǎn)生副作用，而這是更加難以預(yù)防和避免的。
守望
面對(duì)意想不到的編輯后果和難以預(yù)測(cè)的DNA修復(fù)，今后的研究需要更清楚的掌握CRISPR的機(jī)制并設(shè)法尋找控制CRISPR，減少其對(duì)基因組帶來的不必要的編輯和突變。尊龍凱時(shí)作為新藥研發(fā)CRO，也將密切關(guān)注基因編輯療法的研究進(jìn)展，守望基因編輯療法的成熟和穩(wěn)定運(yùn)用，助力人類健康的進(jìn)一步改善！
參考鏈接：
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http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2014/crispr-a-game-changing-genetic-engineering-technique/
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http://www.nature.com/articles/s41591-020-0840-5
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http://www.nature.com/articles/d41586-020-01906-4
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