SARS-CoV-2是一種有包膜的單鏈RNA 病毒，病毒RNA通過核糖體移碼產生兩個多聚蛋白：pp1a和pp1ab。多蛋白由木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PL pro）處理，其切割3個位點釋放非結構蛋白nsp1-3和一種3C樣蛋白酶，也稱為主要蛋白酶（M pro）。在11個位點切割以釋放非結構蛋白，這些非結構蛋白形成復制酶復合體，負責病毒基因組的復制和轉錄，因此使得M pro和PL Pro成為抗病毒藥物開發的主要目標。
結構生物學可以起到藥物開發的關鍵作用，但直接靶向SARS-CoV-2的藥物仍然令人難以捉摸。近日，《Nature Communications》上的一篇新論文概述了一個國際研究團隊如何確定潛在的方法，以快速設計出與COVID-19對抗的改進且功能更強的化合物。研究人員通過結合質譜和X射線方法對SARS-CoV-2主蛋白酶進行了大規模的親電試劑和非共價片段篩選病毒復制，晶體學屏幕確定了覆蓋整個活動位點的71個匹配以及二聚體界面的3個匹配。這些組合提供了前所未有的結構和反應性信息，可用于正在進行的針對SARS-CoV-2主蛋白酶結構的藥物設計。
Part 1
M pro以無配體形式結晶，衍射至接近原子分辨率
不含配體的M pro的晶體結構適合X射線片段篩選（來源：Nature Communications）
晶體形式非常適合晶體碎片篩查，盡管蛋白晶體的溶劑百分比非常低，但是仍然存在清晰的通道可以通過擴散進入活性位點。此外，當向結晶液滴中添加可溶解的碎片時，緊密堆積和牢固的先天衍射平均晶體可抵抗晶格破壞和DMSO溶劑對衍射的降解。
Part 2
結合MS和晶體學碎片篩查揭示了M pro的新結合劑
結晶碎片屏幕的時間線（來源：Nature Communications）
為了確定共價起點，研究人員使用完整蛋白質譜法篩選了先前描述的針對Mpro的約1000個輕度親電片段庫。含有化合物N-（chloroacetyl）aniline基序是頻繁擊打者，因為這樣的化合物是高反應性的。因此，研究人員選擇反應性相對較低的系列成員進行后續結晶嘗試，對于包含N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的另一系列命中化合物，它們顯示較低的反應性并且在以前的篩選中不經常發生擊打。
雖然溫和的親電片段非常適合探測活性位點半胱氨酸周圍的結合特性，但它們的小尺寸卻阻止了對底物結合的廣泛探索。研究人員進行了另一次晶體學碎片篩查，以詳盡地探查Mpro活性位點，并尋找碎片合并或生長的機會。將68個親電子片段命中以及來自7個文庫的總共1176個獨特片段添加到晶體中，非共價片段被浸泡，而親電試劑片段既被浸泡又被共結晶，以確保在結構上觀察到盡可能多的質譜圖。總共1742次浸泡和1139次共結晶實驗產生了1877個鑲嵌晶體，盡管有些碎片破壞了晶體或衍射，但仍然收集到了1638個分辨率高于2.8?的數據集。
Part 3
非共價片段命中揭示了活性位點中的多個可靶向亞位點
研究人員共鑒定出八個片段結合在S1亞位點上，并通過吡啶環或類似的含氮雜環與關鍵殘基的側鏈形成相互作用，通過酰胺或脲部分中的羰基與Glu166形成相互作用。與其他亞位點相比，亞位點S2先前已顯示出更大的靈活性，可適應肽基抑制劑中較小的取代基，但會優先選擇亮氨酸或其他疏水殘基。許多片段在此位置結合，研究人員稱其為“芳香輪”，是因為芳香環的一致基序與Met49形成疏水相互作用，或與His41形成π-π堆積，基團分別在4個軸向上放置。
結合的片段對活動位點進行了全面采樣（來源：Nature Communications）
在探索亞位點S3的四個片段中，其中三個片段帶有一個磺酰胺基的芳環，該磺酰胺基與Gln189形成氫鍵，并朝著溶劑界面指向活性位點，這些命中具有適合利用上述相同的His164 / Met165 / Asp187口袋的擴展載體。
已經確定，對于類似的病毒蛋白酶如SARS-CoV的-1蛋白酶的生物學單元是二聚體，并且在突變二聚體界面可以破壞蛋白酶活性，因此干擾二聚化的化合物可能充當蛋白酶活性的準變構抑制劑。在這項研究中，三種化合物結合在二聚體界面的可及位置，可以想象到利用它們來設計化合物來破壞M pro二聚體。
二聚體界面的片段表示變構調節的機會（來源：Nature Communications）
片段Z1849009686（×1086）結合在由Met6、Phe8、Arg298和Val303的側鏈形成的疏水口袋中，它還介導了兩個氫鍵與Gln127的側鏈和Met6的骨架。Z264347221（×1187）類似地結合在由Met6，Phe8和Arg298制成的疏水性口袋中，延伸穿過二聚體界面以與第二個原發性蛋白的Ser123、Tyr118和Leu141相互作用，包括氫鍵Ser123的側鏈和主干。最后是POB0073（x0887），在二聚體界面處僅與Gly2結合4?，被包裹在一個前體的Lys137和Val171之間，而另一個包裹在Gly2、Arg4、Phe3、Lys5和Leu282之間，包括兩個與Phe3骨架相連的氫鍵。
Part 4
共價片段命中揭示了幾個易處理的系列
在所有具有親電試劑結合的結構中，N-氯乙酰基羰基氧原子與Gly143、Ser144或Cys145的骨架酰胺氫形成兩個或三個氫鍵，包含N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的所有三種化合物都采用類似的指向S2口袋的結合方式。
共價片段錨定在Cys145處并取樣正構M pro結合袋的不同區域（來源：Nature Communications）
一系列含有N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的化合物顯示出了有前途的結合模式。為了跟蹤這些化合物，研究人員進行了第二代化合物的快速合成。通過N-氯乙酰基哌啶-4-羰基氯與各種內部胺（優選帶有發色團以簡化純化）的反應，可以以毫克級獲得這種化學型的衍生物。這些新化合物通過完整蛋白質質譜法測試，以評估蛋白質標記。源自非極性胺的酰胺大多勝過其極性對應物，這暗示了在該方向上可靶向的親脂性亞區域。兩種具有最高標記的PG-COV-35和PG-COV-34的酰胺突出顯示了分別通過酰胺N-烷基化或交叉偶聯進一步合成衍生化的潛力。
突出顯示的結構-活性關系對于進一步優化很重要。溴炔具有固有的硫醇反應性，它比已建立的基于丙烯酰胺的共價抑制劑的固有硫醇反應性低。炔烴的幾何形狀及其結合方式也表明，可以用可逆的共價基團（例如腈）代替，它可以通過相同的非共價相互作用進行引導。兩個共價命中物（2-氰基嘧啶和2-氰基咪唑）來自小型雜環親電子試劑庫，它們實質上是由五元和六元氮組成，含具有吸電子特性的雜環，可激活小的親電子取代基（鹵素，乙基，乙烯基和腈基）。
Part 5
結果與討論
本研究提供的數據為從SARS-CoV-2開發有效的M pro抑制劑提供了許多明確的途徑。結合的片段全面采樣了活性位點的所有子位點，揭示了不同的擴增載體，并且親電試劑為設計共價化合物提供了系統的和偶然的廣泛數據。人們普遍認為，新的小分子藥物不能以足夠快的速度開發出來以幫助對抗COVID-19。然而，由于大流行病威脅仍將是一個長期問題，并且候選疫苗不能保證提供全面和持久的保護，因此抗病毒分子將仍然是重要的防御線，這類化合物還需要與未來的流行病作斗爭，此項研究得出的數據將加速此類工作進展。
總的來說，共價命中提供了低反應性和高選擇性抑制劑的合理途徑。合理設計的共價藥物獲得牽引力，許多最近FDA批準的藥物，它們的設計是基于非常有效的非共價結合，即允許低反應性親電的精確定位，所以共價鍵的形成即是結合位點特異性的依賴。碎片方法已成為現代藥物發現的一種主要方法，使用了少量化合物（ < 300Da）的小集合 （100s或1000s ），這些化合物雜亂地結合在一起，因此比HTS獲得的化學空間要大得多。面臨的挑戰是，片段擊中的結合非常弱，需要高度靈敏的生物物理檢測，對結合的仔細確認以及專業的化學知識才能將這些擊中并發展為完全有效的候選藥物。但真正的希望是可以將它們快速有效地轉化為有效的候選藥物，并通過更簡單的途徑將其轉化為臨床藥物。
世界上的焦點一直放在疫苗和現有藥物的再利用上，但是該項研究是少數嘗試新型小分子療法的項目之一。該研究團隊采取了極為不同尋常的途徑，即在生成所有實驗數據后立即將其發布，因此結果將可供全球任何一家藥品制造商使用。國際社會對此項研究數據實時發布的反應更為出色，紛紛調動了大量的專業知識、技術和慈善事業，并演變成一種獨特而嚴格的藥物發現工作旨在迅速開發出具有良好安全性和臨床前特性的的口服抗病毒藥物。尊龍凱時作為新藥研發CRO也會持續關注此項研究進展。
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